RT-PCR-testen
"Å lage noe ut av ingenting": PCR-tester, CT-verdier og falske positive
Niels Harrit PhD
27. mai 2021
Hvis vaksinasjon kan brukes som verifisering av Corman-Drosten RT-PCR-testen for Covid-19, bør omtrent 50 % av de positive resultatene som rapporteres anses som falske når ikke mer enn 35 sykluser brukes. Hvis bare 25 sykluser brukes, synker andelen falske positive til 20 %.
Effektiviteten av RT-PCR-testen, som brukes til å identifisere infeksjon med SARS-CoV-2-viruset og "tilfeller" av Covid-19-sykdommen, er bredt omdiskutert. I disse diskusjonene hevdes det ofte at testen gir 97 % falske positive. Denne påstanden henviser til en studie av en gruppe fra Marseille, som publiserte sine resultater i et brev til Oxford-akademiet den 28. september 2020 (https://academic.oup.com/cid/article/72/11/e921/5912603) [1].
Førsteforfatteren er R. Jaafar, og studien kalles derfor Jaafar-artikkelen. Den representerer et utvidet datasett i forhold til en tidligere studie ledet av B. La Scola, omtalt som La Scola-artikkelen. Resultatene i Jaafar-artikkelen gir imidlertid ikke selvstendig bevis for at testen produserer 97 % falske positive. Denne kommentaren er et forsøk på å trekke ut de viktigste konklusjonene fra dataene deres.
Det har også vært forvirring rundt forkortelsen "RT-PCR", som noen ganger refereres til som "Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction" og andre ganger som "Real Time PCR". Begge er korrekte betegnelser; det er Real Time RT-PCR.
Enzymet revers transkriptase behandler enkeltstrenget RNA i prøven og omdanner det til dobbeltstrenget DNA i en rekke trinn. Deretter begynner polymeraseenzymet å lage kopier av det utvalgte DNA-et. Utvalget bestemmes av primere som er nødvendige for å starte prosessen.
Replikasjonen foregår i sykluser. Hver syklus begynner med oppvarming av prøven for å skille DNA-dobbeltspiralen i to frie DNA-strenger, som fungerer som maler for polymerasen til å produsere komplementære strenger fra byggesteinene i løsningen. Ved avkjøling settes strengene sammen igjen, og syklusen er fullført, hvilket resulterer i en dobling av DNA-molekylene etter hver syklus.
Under produksjonen er DNA-et merket med et sondemolekyl som kun fluorescerer når det inkorporeres i DNA. Prøven avgir dermed synlig lys når den belyses med en liten laser. Fluorescensintensiteten registreres for hver syklus av PCR som en måling av mengden DNA som produseres, og dette er hvor real-time-delen kommer inn. Når et forhåndsbestemt nivå er nådd, stoppes multiplikasjonsprosessen, og testen anses som "positiv".
Antall sykluser som kreves for å nå det kritiske nivået av fluorescens kalles syklusterskelen, Ct, som er karakteristisk for hver prøve. Det er klart at hvis prosessen starter med mange RNA-fragmenter, nås fluorescensnivået tidlig, og Ct-verdien er lav. Hvis den innledende mengden kun er noen få RNA-molekyler, kan det ta mange sykluser for å nå det kritiske signalet.
Dette betyr at Ct-verdien potensielt kan gi en kvantitativ måling av virusbelastningen hos en person. Det kan være nyttig hvis man ønsker en kvantitativ måling av sin midlertidige tilstand. En fremtidig samtale kunne være som følger:
"Hvordan har du det?"
"Jeg var på testsenteret. De sa at jeg har det fint. Jeg har en Ct på 42 i dag."
Som det fremgår, kan dette svaret bety at person #2 hadde en forkjølelse i fjor høst, men ingen kliniske symptomer i dag. Alle prøver vil være positive hvis man bruker 60 sykluser, fordi "PCR lager noe ut av ingenting", som Kary Mullis – nobelprisvinneren og oppfinneren av PCR-teknologien – en gang sa.
Når det bare er et spørsmål om sykluser før testen er positiv, har vi alle DNA- og/eller RNA-fragmenter – fremmede eller egne – i kroppen som kan oppdages med de nåværende primerne. Ved høye Ct-verdier ender man opp med å forsterke "bakgrunnsmolekylstøyen" av ufarlige genetiske fragmenter.
VI HAR ALLE EN CT HELE TIDEN!
Jaafar-artikkelen er et bidrag til den viktige diskusjonen om den terapeutiske nytten av PCR-metodikken. Mer spesifikt: "Hva er vippepunktet for Ct, hvorunder en PCR gir en meningsfull test for Covid-19, og over hvilken den er meningsløs"?
Fra begynnelsen av Covid-19-utbruddet til forskningen ble fullført i denne publikasjonen, utførte Marseille-instituttet 250 566 SARS-CoV-2-tester på 179 151 pasienter.
Av disse testet 13 161 positive innen 35 sykluser med RT-PCR. Det er 7,3 %.
Av disse positive prøvene ble 3790 inokulert og behandlet for dyrking. Inokuleringsprosessen er mer eller mindre beskrevet i La Scola-artikkelen.
De skriver at "0,5 ml vattpinnevæske ble sentrifugert og inokulert på VERA-celler (apenyrecellelinje) og observert for cytopatisk effekt" - i et uspesifisert antall dager.
Det vil si, døde cellene og gikk i oppløsning? Denne observasjonen må ha blitt gjort under et optisk mikroskop. Hvis de observerte celledød, ble en væskeprøve tatt fra hetteglasset og deretter behandlet for observasjon i et skanningselektronmikroskop.
Forfatterne kaller dette "Presumptive detection of virus in supernatant showing cytopathogenic effect."
Imidlertid ble ingen bilder fra elektronmikroskopet presentert.
Tilstedeværelsen av viruset "bekreftes" videre med RT-PCR på denne væsken. Veldig viktig, Ct-verdiene for disse RT-PCR-ene som kjøres på prøvene som ble utsatt for elektronmikroskopi er ikke gitt. Hvis DNA/RNA valgt av primerne før og etter inokulering målrettet mot det samme viruset, bør de endelige Ct-ene være betydelig lavere enn Ct-ene oppnådd fra de rå vattpinneprøvene. Hvis de ikke var det, vet vi egentlig ikke hvorfor cellene døde.
Men la oss foreløpig anta at celledød er et kriterium for vellykket inokulering og at dødsfallene skyldes det samme viruset som er kvantifisert i RT-PCR-testen.
Således rapporterer Jaafar et al. at inokulering var vellykket i 1941 tilfeller av de 3790 PCR-positive behandlet for kultur. Dette leder oss til den umiddelbare vurderingen at 49 % av de positive PCR-testene kan ha vært falske, i den forstand at pasientens virusmengde må ha vært ubetydelig.
Hvorvidt de 51 % vellykket inokulerte prøvene virkelig representerer en positiv diagnose for sykdommen kalt Covid-19, avhenger av om SARS-CoV-2 virkelig er en unik enhet og om den har blitt isolert og vist å være patogen.
I denne vurderingen reserverer vi derfor betegnelsen «positiv» for en prøve som når den kritiske fluorescensterskelen. De "positive" inkluderer de inokulerbare og de ikke-inokulerbare prøvene (som er falske positive).
Dataene fra Jaafar-artikkelen er gjengitt i figur 1. Den viser fordelingen mellom inokulerbare og ikke-inokulerbare prøver for hver gruppe av Cts fra 11 (Ct11) til 37 (Ct37) sykluser.
Ja, inokuleringsmidler utgjør bare 3 % av Ct35-gruppen. Men siden bare 74 prøver måtte tas så langt, betyr ikke dette at RT-PCR-testen generelt gir 97 % falske positive. Bildet er mer mangfoldig.
De samme dataene er vist på en mer tradisjonell måte i figur 2.
Vi søker svar på spørsmålet: Hvor mange sykluser bør være standard hvis vi vil at 80 % av de positive skal representere en inokulerbar prøve?
I figur 3 (til venstre) er antallet inokulerbare eller ikke-inokulerbare prøver opp til Ct-verdien. Det vil si at kurvene i figur 2 er integrert.
I figur 3 (til høyre) er de samme dataene vist som en prosentandel av det totale antallet dyrkede prøver opp til Ct.
Det er sett at ved Ct25 vil 80 % av prøvene som kalles "positive" ved RT-PCR-testen være inokulerbare. Imidlertid vil 20 % av de "positive" være falske hvis inokulering er en målestokk for effektiviteten til RT-PCR. Noen kan finne det akseptabelt.
Så hvis 1) noe sånt som et unikt SARS-CoV-2-virus eksisterer, hvis 2) dette viruset forårsaker alvorlige luftveissymptomer, hvis 3) viruset kan inokuleres i VERA-celler, hvis 4) VERA-celler er en gyldig representasjon av mennesker, og hvis 5) Corman-Drosten-testen virkelig oppdager SARS-CoV-2 spesifikt, kan det ha noen fordeler for en lege, der den kliniske settingen er en pasient med alvorlige luftveissymptomer, å kjøre en RT-PCR til Ct = 25 som en tilleggsprøve.
Det er litt langsøkt, er det ikke?
Det koker virkelig ned til primerne, deres spesifisitet og nytte ved lave konsentrasjoner. Hvordan kan de målrette mot et dødelig SARS-CoV-2-virus når det ennå ikke er bevist? I tillegg finnes sekvensene til de forskjellige primerne som brukes ikke bare i ca. 100 bakterier, men de er også rikelig i det menneskelige genomet.
Paring av to DNA-tråder – hybridisering – trenger ikke å være perfekt for å skje. Hvis de to strengene for eksempel bare er 80 % komplementære, vil bindingskonstanten reduseres. Men hybridisering skjer uansett. Når en grovt overdreven konsentrasjon av primere brukes i standard Corman-Drosten-testen, er den bevisst bundet til å plukke opp annet DNA som flyter rundt, enten det er produsert av revers transkriptase eller ikke.
EN RT-PCR-TESTKJØRING PÅ CT25
Hvilket resultat kan forventes HVIS Corman-Drosten-testen oppdaget noe som heter SARS-CoV-2 og ble kjørt med maksimalt 25 sykluser?
Vurder i figur 4 (til venstre) hvordan det totale antallet dyrkede prøver øker delvis lineært med antall sykluser. Dette er i samsvar med synet om at antall kulturer pr Ct-gruppen når et platå utenfor Ct ~ 20 (Figur 2), men bare merkbart hvis utvalget av prøver som skal dyrkes var tilfeldig.
Av denne undergruppen (3790) som ble sendt til dyrking - valgt fra de som ble kalt positive ved RT-PCR-testen innen 35 sykluser - ville bare 1813 blitt registrert som positive hvis bare 25 sykluser hadde blitt brukt (Figur 4, venstre), tilsvarende 48 % av undergruppen (Figur 4, høyre).
Siden 7,3 % testet positivt ved RT-PCR i løpet av 35 sykluser, kan det forventes at 7,3 x 0,48 = 3,5 % vil bli returnert som positivt dersom antall sykluser begrenses til 25.
Av disse kan 2,8 % være troverdige (80 % i henhold til inokulering), mens 0,7 % kan være falske positive – IF inokulering er en gyldig bekreftelsesmetode og alle andre betingelser er oppfylt!
SLUTTMERK
Å være syk er å ha symptomer. Hvis du ikke er syk, er du ikke bærer av infeksjonen. Det pleide å være sunn fornuft at du er frisk med mindre det motsatte er bevist.
Sunn fornuft er ikke lenger vanlig under den påståtte Covid-19-pandemien. Nå er du syk inntil det motsatte er bevist – og i bunn og grunn er du smittsom. Kjøretøyet for denne svindelen er RT-PCR-testkjøringen ved >35 sykluser og over. Slutt å teste og overlev.