RT-PCR-testen
"Skabe noget ud af ingenting": PCR-tests, CT-værdier og falske positiver
Niels Harrit PhD
27. maj 2021
Hvis vaccination kan bruges som verifikation af Corman-Drosten RT-PCR-testen for Covid-19, skal omkring 50% af de positive resultater, der rapporteres, betragtes som falske, når der anvendes højst 35 cyklusser. Hvis kun 25 cyklusser anvendes, falder andelen af falske positiver til 20%.
Effektiviteten af RT-PCR-testen, der bruges til at identificere infektion med SARS-CoV-2-virus og "tilfælde" af Covid-19-sygdommen, er bredt omstridt. I disse diskussioner hævdes det ofte, at testen producerer 97% falske positiver. Reference til denne påstand er en undersøgelse af en gruppe fra Marseille, der offentliggjorde deres resultater i et brev til Oxford akademi (https://academic.oup.com/cid/article/72/11/e921/5912603) den 28. september 2020. [1]
Første forfatter er R. Jaafar, så den kaldes herefter Jaafar-artiklen. Den repræsenterer et udvidet datasæt i forhold til en tidligere undersøgelse ledet af B. La Scola. Denne publikation kaldes La Scola-artiklen.
I alt viser resultaterne præsenteret i Jaafar-artiklen ikke et selvstændig bevis for, at testen producerer 97% falske positiver. Denne kommentar er et forsøg på at udtrække de væsentlige konklusioner fra deres data.
Der har også været forvirring omkring forkortelsen "RT-PCR", der nogle gange refereres til som "Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction", mens det i andre tilfælde forklares som "Real Time PCR".
Det er begge dele. Det er Real Time RT-PCR.
Enzymet reverse transcriptase adresserer enkeltstrenget RNA i vatpinden og omdanner dem til dobbeltstrenget DNA i en række trin. Derefter begynder polymeraseenzymet at lave kopier af udvalgt DNA. Udvælgelsen bestemmes af et par såkaldte primere, der er nødvendige for at starte processen.
Replikationen forekommer i cykler. Hver cyklus begynder ved opvarmning af prøven for at adskille DNA-dobbeltspiral i to frie DNA-strenge. Disse tjener som skabeloner for polymerasen til at producere komplementære strenge af hver ud af byggestenene til stede i suppen.
Ved køling rekomponeres strengene. Cyklussen er afsluttet. Resultatet er en fordobling af antallet af DNA-molekyler til stede før cyklussen.
Under produktionen er DNA mærket med en sondemolekyle, der kun fluorescerer, når det inkorporeres i DNA. Så prøven udsender synligt lys, når den belyses med en lille laser. Fluorescensintensiteten registreres for hver cyklus af PCR som en måling af mængden af DNA, der produceres. Det er her, real-time kommer ind. Når et forudbestemt niveau er nået, stoppes multiplikationsprocessen, og testen kaldes "positiv".
Antallet af cyklusser, der kræves for at producere det kritiske niveau af fluorescens, kaldes cyklustærskel, Ct, som er en karakteristik af hver prøve. Det er klart, at hvis processen starter med et stort antal RNA-fragmenter, nås tærskel-fluorescensintensiteten tidligt, og Ct er lav. Hvis den indledende belastning kun er et par RNA-molekyler, eller måske endda en enkelt, kan det tage mange cykler at få det kritiske fluorescenssignal.
Dette betyder, at Ct-værdien har potentiale til at give en kvantitativ måling af den virale belastning hos en person. Det kan være praktisk, hvis du ønsker en kvantitativ måling af din midlertidige tilstand.
En fremtidig samtale kunne være sådan her:
"Hvordan har du det?"
"Jeg gik til testcenteret. De fortalte mig, at jeg har det godt. Jeg har en Ct på 42 i dag."
Som det vil fremgå af det følgende, kan denne udveksling betyde, at person #2 havde en forkølelse sidste efterår, men ingen kliniske symptomer i dag. Alle prøver er positive, hvis der anvendes 60 cykler, fordi "PCR laver noget ud af ingenting", som Kary Mullis - nobelprisvinderen og opfinderen af PCR-teknologien - engang sagde.
Når det kun er et spørgsmål om cykler, før testen er positiv, må vi alle have DNA- og/eller RNA-fragmenter - udenlandske eller indenlandske - i vores krop, der målrettes af de nuværende primere. Ved høje Ct-værdier ender du med at forstærke "baggrunds-molekylstøjen" af harmløse genetiske fragmenter.
VI HAR ALLE EN CT HELE TIDEN!
Jaafar-artiklen er et bidrag til den vigtige diskussion om den terapeutiske nytte af PCR-metodikken. Mere specifikt: "Hvad er vippepunktet for Ct, under hvilket en PCR giver en meningsfuld test for Covid-19, og over hvilket den er meningsløs"?
Fra begyndelsen af Covid-19-udbruddet indtil forskningen blev afsluttet i denne publikation udførte instituttet i Marseille 250.566 SARS-CoV-2-tests for 179.151 patienter.
Af disse testede 13.161 positive inden for 35 cyklusser af RT-PCR. Det er 7,3%.
Af disse positive prøver blev 3790 inokuleret og behandlet til kultur. Processen med inokulation beskrives mere eller mindre i La Scola-artiklen.
De skriver, at "0,5 ml vatpindsvæske blev centrifugeret og inokuleret på VERA-celler (abe nyrecellelinje) og observeret for cytopatisk effekt" - i et ikke nærmere angivet antal dage.
Det vil sige, døde cellerne og disintegrerede de? Denne observation skal være gjort under et optisk mikroskop. Hvis de observerede celledød, blev der taget en væskeprøve fra hætteglasset og behandlet derefter til observation i et scanningelektronmikroskop.
Forfatterne kalder dette "Presumptive detection of virus in supernatant showing cytopathogenic effect."På dansk betyder det: "Hvis vi ser abecellerne dø og disintegrere i det optiske mikroskop, tager vi prøven til elektronmikroskopet og tror, at hvad end vi ser der, må være virus."
Der blev dog ikke fremlagt billeder fra elektronmikroskopet.
Virussets tilstedeværelse "bekræftes" yderligere med RT-PCR på denne væske. Meget vigtigt er det, at Ct-værdierne for disse RT-PCR'er kørt på prøverne, der blev underkastet elektronmikroskopi, ikke gives. Hvis DNA/RNA valgt af primerne før og efter inokulation målrettede det samme virus, skulle de sidste Ct'er være betydeligt lavere end de Ct'er, der opnås fra de rå vatpinde. Hvis de ikke var det, ved vi virkelig ikke, hvorfor cellerne døde.
Men lad os antage for nu, at celledød er et kriterium for en succesfuld inokulation, og at dødsfaldene skyldes det samme virus, der kvantificeres i RT-PCR-testen.
Således rapporterer Jaafar et al., at inokulationen var vellykket i 1941 tilfælde ud af de 3790 PCR-positive, der blev behandlet til kultur. Dette fører os til den umiddelbare vurdering, at 49% af de positive PCR-tests måske har været falske, i den forstand at patientens virale belastning må have været ubetydelig.
Hvorvidt de 51% vellykkede inokulerede prøver virkelig repræsenterer en positiv diagnose for sygdommen kaldet Covid-19 afhænger af, om SARS-CoV-2 virkelig er en entydig enhed, og om den er blevet isoleret og vist sig at være sygdomsfremkaldende.
I denne vurdering forbeholder vi derfor betegnelsen "positiv" til en prøve, der når den kritiske fluorescensgrænse. De "positive" omfatter de inokulerbare og de ikke-inokulerbare prøver (som er falske positiver).
Dataene fra Jaafar-artiklen er reproduceret i figur 1. Den viser fordelingen mellem inokulerbare og ikke-inokulerbare prøver for hver gruppe af Ct'er, der spænder fra 11 (Ct11) til 37 (Ct37) cyklusser.
Ja, inokulerbare udgør kun 3% af Ct35-gruppen. Men da der kun var behov for at tage 74 prøver så langt, betyder det ikke, at RT-PCR-testen generelt producerer 97% falske positiver. Billedet er mere mangfoldigt.
Samme data vises på en mere traditionel måde i figur 2.
Vi søger et svar på spørgsmålet: Hvor mange cykler skal være standard, hvis vi vil have, at 80% af de positive repræsenterer en inokulerbar prøve?
I figur 3 (venstre) summeres antallet af inokulerbare hhv. ikke-inokulerbare prøver op til Ct-værdien. Det vil sige, kurverne i figur 2 integreres.
I figur 3 (højre) vises de samme data som procentdel af det samlede antal kultiverede prøver op til den Ct.
Det ses, at ved Ct25 vil 80% af prøverne, der kaldes "positive" af RT-PCR-testen, være inokulerbare. Dog vil 20% af "positiverne" være falske, hvis inokulation er en benchmark for effektiviteten af RT-PCR. Nogle kan finde det acceptabelt.
Så hvis der 1) eksisterer noget, som et entydigt SARS-CoV-2-virus, hvis 2) dette virus forårsager alvorlige respiratoriske symptomer, hvis 3) virusset er inokulerbart i VERA-celler, hvis 4) VERA-celler er en gyldig repræsentation af mennesker, og hvis 5) Corman-Drosten-testen virkelig påviser SARS-CoV-2 specifikt, kan det have nogle fordele for en læge, hvor de kliniske rammer er en patient med alvorlige respiratoriske symptomer, at køre en RT-PCR indtil Ct = 25 som en supplerende test.
Det er dog lidt langt ude, ikke sandt?
Det kan virkelig koges ned til primerne, deres specificitet og anvendelighed ved lave koncentrationer. Hvordan kan de målrette sig mod et dødbringende SARS-CoV-2-virus, når dets eksistens stadig skal påvises? Derudover findes sekvenserne af de forskellige primere, der bruges, ikke kun i ca. 100 bakterier, men de er også rigelige i det humane genom.
Sammenkobling af to DNA-strenge - hybridisering - behøver ikke at være perfekt for at forekomme. Hvis de to strenge er, lad os sige, kun 80% komplementære, vil bindingskonstanten blive reduceret. Men hybridisering sker alligevel. Når en voldsomt overdrevet koncentration af primere bruges i standard Corman-Drosten-testen, er den bevidst bundet til at opfange andet DNA, der svæver omkring, uanset om det er produceret af reverse transcriptasen eller ej.
EN RT-PCR-TEST KØRT VED CT25
Hvilket resultat kan forventes, HVIS Corman-Drosten-testen detekterede noget kaldet SARS-CoV-2 og blev kørt ved maksimalt 25 cyklusser?
Overvej i figur 4 (venstre), hvordan det samlede antal kultiverede prøver øges delvist lineært med antallet af cyklusser. Dette er i overensstemmelse med opfattelsen af, at antallet af kulturer pr. Ct-gruppe når et plateau ud over Ct ~ 20 (figur 2), men kun bemærkelsesværdigt, hvis udvælgelsen af prøver, der underkastes kultur, var tilfældig.
Af denne undergruppe (3790) underkastet kultur - udvalgt blandt dem, der blev kaldt positive af RT-PCR-testen inden for 35 cyklusser - ville kun 1813 have været registreret som positive, hvis kun 25 cyklusser var blevet anvendt (figur 4, venstre), svarende til 48% af undergruppen (figur 4, højre).
Da 7,3% blev testet positive ved RT-PCR inden for 35 cyklusser, kan man forvente, at 7,3 x 0,48 = 3,5% vil blive returneret som positive, hvis antallet af cyklusser begrænses til 25.
Af disse kan 2,8% være troværdige (80% ifølge inokulation), mens 0,7% kan være falske positiver - HVIS inokulation er en gyldig bekræftelsesmetode, og alle andre betingelser er opfyldt!
AFSLUTTENDE BEMÆRKNING
At være syg er at have symptomer. Hvis du ikke er syg, er du ikke smittebærer. Det plejede at være almindelig sund fornuft, at du er sund, medmindre det modsatte er bevist.
Sund fornuft er ikke længere almindelig under den påståede Covid-19-pandemi. Nu er du syg, indtil det modsatte er bevist - og som udgangspunkt smitter du. Køretøjet til denne fidus er RT-PCR-testen kørt ved >35 cyklusser og derover. Hold op med at teste og overlev.